Sequence 1

前情提要结束后，玩家／Desmond进入Ezio的一段记忆（Sequence 9），但内容异常混乱。接下来，Ezio的记忆跳回1499年12月的梵蒂冈（《刺客信条2》的尾声），与「女神」Minerva于西斯汀教堂地窖的相遇。 Minerva留下了谜语般的一句话「接下来靠你了...Desmond」后便消失无踪，满腹狐疑的Ezio步出地窖，发现先前倒地的教宗亚历山大六世／Rodrigo Borgia已逃之夭夭，他的权杖也自动封入地底。

这时Ezio的叔叔Mario正好赶来，待Ezio爬出地窖（按住Y键不放打开Eagle Vision可看到攀爬点）后，两人一同离开梵蒂冈。来到河畔，Ezio不知是否该把依甸残片之一的苹果丢入河里，犹豫许久后，Mario要Ezio先把苹果交给他，之后再处理。

两人回到Monteriggioni庄园（二代的基地），受到众人的欢迎。 Ezio的妹妹Claudia出来迎接，并问起敌人的状况，Ezio要她召集阿萨辛的成员在今晚会面。玩家在Monteriggioni庄园里跟随地图上代表任务的惊叹号与导航点完成三个简单的事件（拾取东西并跟随NPC／骑马／使用大炮）、熟悉游戏的流程后，就能回到别墅门口，与Caterina Sponosa碰面并与阿萨辛同志会谈。